ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Imunologi adalah ilmu yang mempelajari sistem imunitas tubuh manusia maupun hewan, merupakan disiplin ilmu yang dalam perkembangannya berakar dari pencegahan dan pengobatan penyakit infeksi. Sedangkan Serologi ialah ilmu yang mempelajari reaksi antigen antibody secara invitro. Pemeriksaan serologik sering dilakukan sebagai upaya menegakkan diagnosis. Walaupun saat ini pemeriksaan serologik tidak terbatas pada penyakit infeksi, namun untuk menunjang diagnosis penyakit infeksi memang hal yang sering dilkukan. memungkinkan dilakukannya pengamatan secara in vitro terhadap perubahan kompleks antigen-antibodi (Ag-Ab).

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label).

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal. (ELISA) adalah suatu teknik  biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai  bidang industri. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas yang lebih tinggi dibandingkan metode imun lainnya. Berdasarkan uraian diatas maka penulis akan membahas tentang ELISA

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang ada maka rumusan masalah yang dibahas dalam makala ini adalah :

1.2.1 Apa itu ELISA?

1.2.2 Bagaimana Jenis-jenis ELISA  ?

1.2.3 Bagaimana prinsip kerja dari metode ELISA ?

1.2.4 Bagaimana contoh cara kerja metode ELISA ?

1.2.5 Apa kelebihan dan kekurangan dari metode ELISA ?

1.3 Tujuan

Berdasarkan rumusan masalah yang ada maka tujuan dari makalah ini  adalah :

1.3.1 Untuk mengetahui pengertian ELISA.

1.3.2 Untuk mengetahui jenis-jenis ELISA.

1.3.3 Untuk mengetahui prinsip kerja dari metode ELISA.

1.3.4 Untuk mengetahui contoh cara kerja dari ELISA.

1.3.5 Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan dari ELISA.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1   Pengertian ELISA  (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang  spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi  secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan  kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif .

2.2   Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.

Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain : ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich, dll.

1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRECT

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

a.  Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.

b.  Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.

c.   Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan yang berbeda.

d.  Amplifikasi signal hanya sedikit.

e.  Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :

a.  Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.

b.  Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.

2.  ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  INDIRECT

ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

1.   Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

2.  Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3.  Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4.  Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5.  Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6.  Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7.  Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

8.  Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

 

(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.

ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

a.  Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody  yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.

Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :

a.  Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.

b.  Immunoreaktifitas  dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.

c.   Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.

3.  ELISA  (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  SANDWICH

Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik  ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.

Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody.

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1.     Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

2.    Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

3.    Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

4.    Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

5.    Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen

6.    Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer

7.    Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang.

8.    Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia

9.    Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain :

·           Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding microtiter.

·           Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct.

 

Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector, kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.

 Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

 

4. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)

Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector (antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan enzim signal).

Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi antibody streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  Multiplex

Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.

6.  ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  COMPETITIVE

Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam lubang mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.

Pada pendeteksian antigen, pertama  mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal, sehingga antibody spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik.

Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibody spesifik.

Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding-dinding mikrotiter.

Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.

Lalu, kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

 

Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody dan antigen.

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

 

 

2.3   Prinsip Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

      Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :

Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

2.4 Contoh Cara Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:

a. Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:

1.   Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.

2.  Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.

3.  Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).

4.  Membilas protein yang tidak melekat.

5.  Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.

6.  Membilas antibody yang tidak terikat.

7.  Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.

8.  Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.

9.  Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.

10.   Inkubasi sampai muncul warna, dan

11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar antibody spesifik dalam sampel.

b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1.   Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.

2.  Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.

3.  Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).

4.  Membilas protein yang tidak melekat.

5.  Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.

6.  Membilas antigen yang tidak terikat.

7.  Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.

8.  Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.

9.  Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.

10.   Inkubasi sampai muncul warna.

11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar kadarantigen spesifi dalam sampel.

Sebagai Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG :

Pada hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluran Tuba fallopi, sel telur akan bergerak menuju Rahim dan melekat pada dinding Rahim tersebut. Sejak saat itulah plasenta akan mengalami perkembangan dan hCG mulai diproduksi. Human Chorionic gonadotropin (hCG) pada dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi oleh sel normal trofoblat pada plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah dan air seni.

hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen dengan berat molekul total 39 kD. Subunit rantai  identic dengan subunit rantai  dari hLH (human Luteinizing Hormone), hFSH (human Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH (human Thyreoidea Stimulating Hormone). Subunit bertanggung jawab pada efek hormonal molekul hCG. Pengukuran hCG yang sempurna dan keberadaan subunit  memberi hasil yang sama pada darah dan urin, tapi tidak pada subunit . Produksi hormone hCG akan bertambah banyak selama trimester pertama, dimana level hCG yang sempurna mempunyai rentang dari 20000 mIU/ml sampai 50000 mIU/ml (1 ng = 15 mIU).

Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan haid, yaitu kira-kira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding Rahim. Kadar hormone tersebut akan terus-menerus bertambah hingga minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak hari terakhir menstruasi. Sebagian besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar hormone hCG sebanyak dua kali lipat setiap 3 hari.

Peningkatan kadar hormone ini biasanya ditandai dengan mual dan pusing yang sering dialami oleh para ibu hamil. Selanjutnya kadar hCG akan menurun terus secara perlahan, dan hamper mencapai kadar normal beberapa saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan pada saat wanita mengalami keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari setalah berhubungan.Sampel yang sigunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya dianjurkan menggunkan air seni yang keluar pertama kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut konsentrasi hormone hCG relatif tinggi. Sebenarnya uji darah pada tes kehamilan yang dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif sama, yait mendekati kadar hCG. Namun, tes darah mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk mendeteksi usia janin bertumbuh di dalam Rahim seorang ibu.

Perkiraan Kadar hCG dalam Darah Kehamilan Trimester kedua
Perempuan yang tidak hamil dan laki-laki		Kurang dari 5 IU/L
		(international units per liter)
IIbu hamil:	24-28 hari setelah haid terakhir	5-100 IU/L
	4-5 minggu (1 bulan) setelah haid terakhir	50-500 IU/L
	5-6 minggu setelah haid terakhir	100-10.000 IU/L
	14-16 minggu (4 bulan) setelah haid terakhir	12.000-270.000 IU/L
	kehamilan trimester ketiga	1.000-50.000 IU/L
Perempuan pasca menopause		Kurang dari 10 IU/L

Keuntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormone hCG antara lain:

1.   Analisa yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya memadai.

2.  Efisien dan fleksibel: sampel yang berbeda dapat dianalisa secara stimulant dengan jumlah cekungan uji yang fleksibel.

3.  Spesifik: sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik berikatan dengan -hCG.

4.  Prosedur yang sederhana.

Dalam pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan sebagai test kehamilan untuk mengetahui keberadaan janin dalam Rahim, juga dapat digunakan untuk berbagai uji kehamilan lainnya, antara lain:

1.   Prediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.

2.  Diagnosis kehamilan yang abnormal.

3.  Penentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.

4.  Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau pria.

5.  Invertigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.

Alat tes hCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di pasaran, yaitu:

1.      Berupa alat yang digunakan dengan cara memaparkannya pada aliran urin saat pertama berkemih di pagi hari selama beberapa saat. Jenis alat ini sangat umum digunakan, karena dijual bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. Berikut ini adalah cara kerjanya:

a.  Pada saat alat tes mulai bekerja, akan muncul garis pada jedela berbentuk lingkaran (Jendela control).Dimana garis tersebut merupakan garis konttrol yang menunjukkan bahwa tes bekerja secara benar.

b.  Jendela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis muncul pada jendela berbentuk persegi (jendela hasil) maka alat tes telah mendeteksi adanya hormone hCG dan mununjukkan adanya kehamilan.

c.   Hasil negatif: Munculnya satu garis pada jendela konttrol (berbentuk lingkaran) menandakan bahwa anda tidak hamil dan tes telah dilakukan dengan benar.

d.  Hasil positif: Muncul 2 garis pada jendela control (berbentuk lingkaran) dan jendela hasil (berbentuk persegi) menandakan anda hamil

e.  Hasil Tidak Valid: Apabila garis pada jendela control tidak muncul berarti tes tidak dilakukan dengan benar.

Berupa alat digunakan dengan cara membubuhi beberapa tetes serum pada mikrotiter. Berikut ini adalah cara kerjanya:

a.    Mengandalkan antibody  -hCG yang terimbolisasi pada media padat yang berikatan dengan -hCG yang bebas dari sampel (urin)

b.    Antibodi kelinci anti- -hCG berkonjungsi dengan horseladish peroxidase (HRP) sebagai larutan konjugasi antibody-enzim.

c.    Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody, menghasilkan -hCG antara fase padat denga antibody-enzim.

d.    Setelah inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim yang tidak terikat. Kemudian substrat HRP, TMB, ditambahkan untuk menghasilkan warna biru.

e.    Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution yang akan mengubah warna kuning.

f.     Konsentrasi -hCG secara langsung proporsional terhadap intensitas warna yang dihasilkan dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer.

2.5 Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :

Ø Teknik pengerjaan relatif sederhana

Ø Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

Ø Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

Ø Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik)

Ø Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

Ø Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).

Ø Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

Ø Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.

Ø Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Berdasarkan tujuan yang ada maka dapat disimpulkan bahwa :

a.      Imunologi adalah suatu cabang yang luas dari ilmu biomedis yang mencakup kajian mengenai semua aspek sistem imun (kekebalan) pada semua organisme.

b.     Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.

c.      Teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain : ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich, dll.

d.     Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi.

e.      Contoh cara kerja metode dapat dilakukan pemeriksaan pada penentuan kadar HCG dalam urin wanita hamil

f.       Tehnik ELISA memiliki kelebihan dan kekurangan dalam proses pemeriksaannya.

3.2 Saran

Semoga dengan adanya makalah ini dapat menambah wawasan terutama bagi penyusun.

DAFTAR PUSTAKA

Brahmana K. 1981. Immunologi, Serologi dan Tata Kerja Laboratorium. Medan.

Suryo. 1996. Genetika. Departemen P dan K Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Jakarta.

Arini Krisna Oktavia. 2012. TES ELISA Melalui http://pandalikespurple.blogspot.com/2012/04/test-elisa.html Diakses 23 Desember 2014